신경과학 연구를 위한 실험쥐 해마의 기관형적 절편 배양의 유용성

• 영문명: Organotypic Slice Culture of Rat Hippocampus for Neuroscience Research
• 발행기관: 대한소아신경학회
• 저자명: 홍순철(Soon Cheul Hong) 윤영철(Young Chul Youn) 이동근(Dong Keun Lee) 김동욱(Dong Wook Kim) 채수안(Soo Ahn Chae)
• 간행물 정보: 『Annals of Child Neurology(구 대한소아신경학회지)』대한소아신경학회지 제11권 제1호, 13~19쪽, 전체 7쪽
• 주제분류: 의약학 > 의학일반
• 파일형태: PDF
• 발행일자: 2003.05.30

국문 초록

목 적 : 실험쥐 해마부위의 기관형적 절편 배양을 정립하여 신경계의 외부자극에 대한 생리학적, 병리학적 반응을 규명하는 신경과학 연구에 관한 유용성을 알아보고자 하였다. 방 법 : 생후 8-9일된 실험쥐의 대뇌를 적출한 다음 dissection microscope 하에서 해마부위를 분리한 후 tissue chopper를 이용하여 450 µm 두께로 절편을 만든 후, Gahwiler's media가 담겨진 6 well plates의 Millicell membrane inserts로 옮겼다.36℃의 humidified CO incubator로 옮긴 후 2-3일 간격으로 배양액을 갈아주며 배양하였다. 이후 일정 배양기간별로 조직 및 신경원의 변화를 광학 현미경으로 관찰 후 Image analysis system을 이용하여 분석 평가하였다. 결 과 : 1) 배양 7일째부터 제대로 된 구조와 적절한 성숙도를 보이기 시작하여 배양 14일경 충분히 성숙된 구조와 신경원을 관찰 할 수 있었다. 2) 배양 4주 이후까지도 조직 배양을 유지할 수 있었으나 장기간 배양 시 감염 및 오염 기회가 높았으며 조직이 배양되면서 절편의 두께가 얇아져, 냉동 절편과 파라핀 블룩을 이용한 염색에 어려움이 있었다. 3) 염색 상 배양 2주 이후의 조직에서 치아이랑, CA 1, 2, 3 지역의 신경원의 모양 및 분포 양상에 커다란 차이가 없었다. 4) 해마부위의 기관형적 절편 배양에서 아교세포와 신경원세포가 자라고 있음을 확인했으며 생체 내 해마에서 발생하는 추체 세포, 과립세포 2종류의 신경원을 발견하였다. 5) Western blotting을 이용하여 NeuN 단백을 확인하였으며, NeuN 단백의 양은 배양 6일째부터 증가하기 시작하여 배양 9일째까지 최고 정점에 이른 후 배양 12일 이후 감소하기 시작하였다. 결 론 : 상기 결과들은 실험쥐 해마의 기관형적 절편 배양이 신경과학의 형태학적 및 분자 생물학적 연구를 위한 유용한 모델이 될 수 있을 것으로 생각된다.

영문 초록

Purpose : Organotypic slice cultures are suitable for morphological and electrophysiological studies, and a valuable method to evaluate physiological and pathological responses to external stimuli. This study was designed to establish a method and to assess its values of organotypic slice cultures of rats' hippocampus for neuroscience research. Methods : 8-day-old neonatal Sprague-Dawley rat's brain was dissected quickly and the brain was removed. Both of the hippocampi were dissected out in Petri dishes and placed on a chopper or tissue cutter with Gey's balanced salt solution(GBSS). Slices of 450µm were cut and separated by adding of a drop of GBBS. Extra GBBS was aspirated. Transfer tissue slices of Millicell membrane were inserted in six-Well plates containing 1 mL of warmed Gahwiler's media. Six-well plates were placed in an incubator at 36℃ with 5% CO and the media were changed regularly every 2 to 3 days. Some tissue were placed in 4% paraformaldehyde for staining and other were placed in Phosphate buffered saline(PBS) for 30 min for Western blotting. Then, we stained the free-floating, cryocutting or paraffin embedded slices with H&E or the days of 6, 9, 14 and 24 in vitro(DIV), and evaluated any changes of tissues and neurons by an image analysis system Results : Hippocampal cultures had well-defined cell body layers of dentate gyrus, CA1, 2, 3, and 4 as early as the day of 6 in vitro(DIV). After 14 DIV, the cultures became gradually thinner from 450 µm to 150 µm. After 21 DIV, there were migrations of cells away from the margins of the slices and degenerative changes of some neuronal cells occurred. But pyramidal cells always were organized in well-defined cellular layer even after several weeks in the culture. Therefore, the best results were obtained by culturing slices of 6 to 14 DIV. Slice cutures was maintained after 4 weeks in vitro, but the opportunity of contamination and infection increased as the periods of cultures trolonged. In staining, after any tissue was cultured in 2 weeks in vitro, no differentiation of the morphology and distribution in dentate gyrus, CA1, 2 and 3 were seen. In organotypic slice culture of rats' hippocampus, we witnessed growth of glial and neuronal cell, and found pyramidal and granular cells. NeuN proteins were identified by Western blotting, and the density of NeuN protein bands was at the maximum value on the day of 9 in vitro. Conclusion : Since the organotypic slice cultures of rats' hippocampus were similar to the hippocampus in vivo in terms of anatomical and cellular morphology, it will become a valuable method for neuroscience research.

키워드

Organotypic slice culture Hippocampus